免疫球蛋白提取分离纯化技术

    免疫球蛋白（Immunoglobulin Ig）的含量代表着机体体液免疫的水平，并进一步代表着B细胞的功能，因此测定血清Ig含量可以推知机体的体液免疫功能和诊断某些疾病引起的Ig的过高和过低。

    随着免疫学的发展和需要，免疫球蛋白的纯化和其成分的提纯成为必不可少的手段。纯化的方法很多，有单一法，但大多数采用二步法以上相结合的方法，特别是以硫酸铵提纯为基础，再经过层析柱的方法来提高免疫球蛋白及其各成分的纯度最为常用。

    硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。不同浓度的硫酸铵盐析蛋白成分不同，利用这一原理提取所需的免疫球蛋白成分。盐析只能粗提，为了获得纯化的免疫球蛋白成分，必须进一步采用层析的方法进行分离。

    免疫球蛋白包括IgG、IgM、IgA、IgE和IgD。例如：

   禽血清IgG的分离与提纯（Na2SO4法）
    1．试剂
    ⑴ 5％葡聚糖硫酸盐
    ⑵ 0.02Mol/L MnCl2溶液
    ⑶ 无水硫酸钠
    ⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液
    ⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液
    2．操作方法
    ⑴ 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl21.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。
    ⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。
    ⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。
    ⑷ 重复步骤⑶，加Na2SO4，使成0.14g/ml。
    ⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。
    ⑹ 过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。
    ⑺ 如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。
    也可以按以下操作方法进行：
    ⑴ 以18％硫酸钠（W/V）提取一次，再以14％的硫酸钠提取一次。
    ⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO42-为止。
    ⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。
    ⑷ 过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。

 

    禽IgA提取与纯化
   （一）材料与试剂配制
    1．禽胆汁
    2．饱和硫酸铵溶液
    3．0.01Mol/L pH7.4PBS液
    4．0.10Mol/L pH6.4PBS液（0.30Mol/L NaCl）
    5． DEAE52-纤维素
   （二）操作方法
    1．取冷藏的胆汁3Ⅹml，缓慢滴加Ⅹml饱和硫酸铵液，边加边搅拌，使成25％饱和硫酸铵液。4℃放置30min。
    2． 3000r/min离心30min，去沉淀。
    3． 取上清，加饱和硫酸铵液，使成35％的饱和度，4℃放置30min。
    4． 3000r/min离心30min，弃上清。
    5． 取沉淀，加0.85％NaCl液溶解，加饱和硫酸铵溶液，重复步骤3和4三次。
    6． 将沉淀用0.85％NaCl液溶解，装入透析袋，以0.01Mol/L pH7.4PBS液透析。
    7． 以0.01Mol/L pH7.4PBS液平衡，过DEAE52纤维柱（20×250mm）。
    8． 取透析样品4ml(﹥20mg/ml蛋白浓度)加入层析柱。以0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱。
    9． 再用0.10Mol/L pH6.4PBS液（NaCl浓度为0.30Mol/L）洗脱，收集洗脱液。
    10．浓缩洗脱蛋白液至20mg/ml，分装，低温冰箱保存。