碱性磷酸酶(AP)的色原底物
在
ELISA测定中，碱性磷酸酶的色原
底物最常用的是对硝基苯磷酸盐(p-nitropheny—
|phosate，pNPP)。pNPP在碱性磷酸酶的作用下生成对硝基酚(pNP)，其在入＝405 nm处有最大吸收.
由于碱性条件下pNP的光吸收增强，并可使碱性磷酸酶失活，因而可使用碳酸钠作为终止剂。二乙醇胺缓冲液中不能有单乙醇胺，因为单乙醇胺对碱性磷酸酶有温度依赖的抑制作用。较高浓度的无机磷可竞争性地抑制碱性磷酸酶的活性，pNPP贮存时间过长由于非酶水解而产生硝基酚和磷酸盐时即可出现这种情况，此时pNPP呈黄色。
因此，用于ELISA测定时，pNPP必须绝对五色。pNP的摩尔消光系数(光吸收)的变化取决于溶液的pH及温度、离子强度、蛋白含量，当温度从15~C升高至45℃时，pNP在入＝405 nm处的光吸收将增加5％～7％。
在ELISA测定时，pNPP色原底物的具体配方为①显色底物溶液：将pNPP以10 mmol／L的浓度溶于含1 mmol／LMgCl：的0．1 mol／L二乙醇胺缓冲液(pH 9．8)，即可应用；②终止液：0．5 mol／L碳酸钠；③测定波长：405nm。
