由于在酶标记抗体过程中，酶与抗体的结合可损害部分抗体和酶的活性，从而降低了抗体的效价。另外，血清中的非特异性抗体也可以被酶标记，这些非特异酶标记抗体与组织中相应抗原结合，放大了非特异背景染色。为了避免酶标记抗体法的上述缺点，Sternberger(1969)在酶标抗体法的基础上，创建了非标记抗体免疫酶技术。该方法先用酶(HRP或AKP)去免动物(羊、兔和鼠等)，使其产生高效价、特异性的抗酶抗体，再将该抗酶抗体与酶结合，形成五环的复合物，例如PAP(HRP)、APAAP(AKP)、GOAGO(GO)复合物。该复合物由于没有一个抗体受到共价键的标记，保留了免疫活性，相对分子质量较小，对细胞的穿透性好。该技术主要有酶桥法和过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)复合物法，以及一些变型的方法。
(一)基本原理
首先用酶免疫动物制备成效价高、特异性强的抗酶抗体。在特异性抗体与抗酶抗体之间利用第二抗体作“桥梁”，将它们连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色显示抗原的定位。其基本流程为：抗原+特异性抗体一第二抗体(桥抗)一抗HRP抗体一HRP一DAB+H202(显色)。因为桥抗体对特异性抗体的量是过剩的，与特异性抗体结合后还剩有抗原结合位点，能与抗酶抗体结合，所以桥抗体能起到连接特异性抗体和抗酶抗体的作用。在此过程中，酶是利用免疫学原理与抗酶抗体结合的，从而避免了由于酶标记抗体而引起的酶和抗体的活性损害，提高了方法的敏感性，降低了非特异性染色。
(二)染色步骤
(1)～(4)同酶标抗体直接法。
(5)适当稀释的特异性一抗(例如来自种属A)37℃孵育60min或4℃过夜PBS洗3×3min。
(6)第二抗体(也称桥抗体，抗种属A的IgG抗体)37~C孵育40min，PBS洗3×3min。
(7)抗酶抗体(来自种属A)37℃孵育40min，PBS洗3 × 3min。
(8)酶(HRP 70～lOOpg／m1，PBS溶解)37~C孵育40min，PBS洗3×3min
(9)显色复染同酶标抗体直接法。
因该方法比PAP法麻烦，现已被PAP法所取代，故很少应用。
