C3裂解产物C3d的定量检测
C3d的定量检测采用
ELISA双抗体夹心法，其原理为抗C3d血清能与C3、C3b、C3bi发生交叉反应，根据C3SP与C3在不同浓度PEG中溶解度的不同，用11％PEG溶解待测样本中C3d，然后加至包被抗C3d反应板中，再依次加入HRP标记的抗C3d抗体和底物OPD/H
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2，用4mol/L H
2S0
4终止反应，于492nm读取吸光度，C3d含量与其吸光度呈正相关。
1．10mmol／LEDTA抗凝正常人或病人全血，2500r／rain离心10min,取血浆置—70℃保存。
2．C3d标准品的制备 将菊糖按3mg／mL与正常人血清混合，37℃孵育1h，2000r／min离心30min，取上清作为C3d标准品。100ulC3d标准品加等体积22％(W／V)PEG 6 0004℃孵育1h，混合物于4℃2000r／min离心30rain，取上清用含0．01％BSA的PBS 1：1 000稀释，然后对倍稀释到1：25 600。
3．用1．0／ug／mL、5．0ug／mL、10．0ug／mL三个浓度的兔抗人C3d抗体(Dakpatt产品)分别包被三个酶标板，每孔100t&4℃24h，次日取出，每孔加含1％BSA的PBS 100／uL，37℃21h，然后加上述稀释的上清100uL混匀，37℃反应1h，用0．5％酪蛋白缓冲液洗涤3次，加100uLl：1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗人C3d抗体，37℃ 45rain，用0．5％酪蛋白缓冲液洗涤2次，最后用PBS洗1次，每孔加lOOuL0．4mg／mL OPD底物溶液，然后加4mol／L H2S04终止反应，于酶标仪上492nm读取OD值。
4．样本中C3d的检测 选择上述反应性好，结果清楚的酶标板的抗体浓度作为工作浓度，包被酶标板，4cC24h。取待检样本(血浆、尿液或脑脊液)100／uL加lOOgL 22％(W／V)PEG6 000,4T；1h，然后4℃2000r／min离心30min，取上清。正常人血浆上清1：250稀释、尿液1：8释、脑脊液1：32稀释，病人血浆上清1；1 000稀释、尿液、脑脊液同正常人，稀释液为PBS。用含0．01％BSA的PBS从1：400-1：6,1130对倍稀释C3d标准品，然后将各稀释度的C3d标准品和稀释的样本各100ti分别加入包被有兔抗人C3d抗体的酶标板中，随后操作同步骤(3)。
5．结果计算 样本C3d的定量测定用AU／L(设想单位)表示，C3d标准品1：250稀释度被指定为1 600AU／L，依次类推。标准曲线浓度范围为100—6．25AU／L，以标准品浓度为横坐标，OD值为纵坐标绘制标准曲线图，根据标准曲线计算待测样本中C3d含量。
正常值：血浆为8．48±1。91AU／L(X±1SD)，尿液为0．87±0。61mAU／L。
