CSA方法在荧光原位杂交中的应用
CSA技术提供的敏感性，对于荧光
原位杂交(FISH)检测相当低水平的短寡聚核苷酸探针和低丰度mRNA非常重要。其原理见图3—10。在甲醛固定、石蜡包埋组织切片中进行低丰度mRNA检测非常困难，如用FISH方法，1000碱基以下小探针应用CSA检测技术可能非常重要。
Breininger和Baskin(2000)报道了一种比单一CSA法更为敏感的荧光原位杂交检测技术，一种进行mRNA超敏检测的二种不同方法相结合的放大法，即生物素标记的核酸探针CSA检测方法与ELF—97磷酸酶底物的碱性磷酸酶介导的荧光产生技术方法。应用CSA—ELF技术检测大鼠下丘脑中勒帕茄碱受体(。bRb)寡核苷酸探针。当单一用CSA或ELF方法均没有检测到前鸦片黑皮质素(POMC)和神经肽Y(NPY)mRNA；当联合CSAELF方法时，可以检测到阳性信号。其操作步骤如下。
(1)
大鼠下丘脑经4％多聚甲醛固定4h，25％蔗糖处理24h(组织沉底)，8btm冰冻切片，晾干后用4％多聚甲醛固定30min，系列乙醇脱水，晾干后PBS洗。切片用0．1％活性DEPC水孵育30min，PBS洗，0．3％H202抑制内源性过氧化物酶30min，PBS洗3×3min。
(2)杂交前处理 2gg／m1蛋白酶K 37℃孵育20min，PBS洗3×3min，甘氨酸—PBS洗10min，2×SSC洗10min。
(3)预杂交 5×SSC、50％甲酰胺、变性鲑精DNA 50Mg／m1，用1m01／L HCl调pH值至7．5，58℃预杂交2h。
(4)杂交 杂交液中含100—500ng／ml Dig或生物素标记cRNA探针，58℃杂交12—18h。
(5)杂交后洗涤 先后用2×SSC和0．1XSSC在55℃各洗30min，切片再用内含1％BSA、0．2％脱脂奶粉、0．3％TritonX—100的PBS(PBS—BB)洗10min，PBS洗5min。
(6)信号放大 生物素标记探针用链霉亲和素—HRPl：200于37℃孵育30min，PBS—BB洗3× 5min，生物素化酪胺酰胺1：500(0．07mmol／L，0．003％H202)于37℃孵育15min，切片用PBS—BB洗3×5min，链霉亲和素—荧光染料1：100于37℃孵育30min，PBS洗3×5min。甘油封片(50％甘油牛TBpH9．0)，荧光显微镜观察。
(7)ELF放大 当上述经CSA信号放大后，结果不够理想，可在第(6)步生物素化酪胺酰胺后，用阻断缓冲液洗30min(阻断缓冲液：30mmol／L丁ris盐、150mm01／L氯化钠、1％BSA、0．5％丁ritonX—100和1mm01／L左旋咪唑，pH7．4)，链霉亲和素—AKP 1：200于37℃孵育30min，PBS-BB洗3X5min，PBS洗3X5min，滴加ELF磷酸盐底物1：20稀释，用0．2／zm旋转过滤器过滤，并将试剂盒中的A液和B液加入到过滤器中，终浓度为1：500稀释，室温中孵育10rain。切片用缓冲液洗5min终止反应。甘油封片，荧光显微镜观察。
(8)结果观察。应注意CSA并不是解决FISH敏感性的灵丹妙药，因为特异性和非特异性结合的信号都被放大。与常规IHC检测方法相比，用CSA技术进行FISH检测，最佳探针浓度应降低2～10倍，可减少昂贵杂交探针的费用。
