辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（PAP法）
酶桥法虽克服了酶标记
抗体法的某些缺点，有效地保护了抗体及酶的活性，但抗酶抗体必须高度纯化，否则将降低其敏感性。这是因为：①在抗酶抗体血清中含有高亲和力和低亲和力两种抗酶抗体，而桥抗体对两者都具有同样的亲和力。虽然这种亲和力主要决定于桥抗体，但低亲和力抗酶抗体对酶的结合力较弱，在染色过程中，会使大部分酶丢失，从而降低了方法的敏感性；②抗酶抗体血清中的非特异性抗体虽不能与酶结合，但能与第二抗体(桥抗体)结合，与抗酶抗体竞争桥抗体分子上的结合位点，从而减少了抗酶抗体的结合，也影响到方法的敏感性。为此，Sternkerger等(1970)在此基础上进行了改良，建立了辣根过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法(peroxidase antiperoxidase complex method，简称PAP法)。
(一)PAP复合物的特点
PAP复合物的特点与该法试剂制备方法有关。首先用HRP去免疫动物，使其产生高效
价、高特异性的抗HRP抗体，然后用HRP与之结合，因是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的形成不同于其他抗原—抗体反应。在抗原稍过量时，所有的抗HRP抗体均参与形成可溶性PAP复合物，仅残留少许游离的HRP。而大多数抗原—抗体反应需要抗原绝对过量才能形成可溶性复合物。PAP复合物的形状相当稳定，不受抗原量的影响，无论最初加入的抗原、抗体过量与否，最终形成的PAP复合物其HRP／抗HRP之比绝大多数为3；2，应用离心沉降、液相扩散及电镜观察等方法，显示PAP复合物呈五角环状结构，3个角为HRP，另2个角为抗HRP抗体，分子质量为400～430kDa，此结构非常稳定。
PAP复合物的环状结构使PAP法具有以下三个特点：
(1)抗体活性高 非标记抗体酶法最大限度地保存了抗体活性，这是因为在所有的反应过程中，任何抗体均未被酶连接，避免了标记过程中对抗体活性的损害。
(2)灵敏度高 实验证实，一般情况下PAP法比间接酶标法敏感20倍。这是因为形成PAP复合物时，过氧化物酶(HRP)已相当稳定，经洗涤不再发生丢失。
(3)背景染色低 PAP法中，连接抗体中即使存在非特异性抗体，因其不是抗IgG的特异性抗体，故不能与抗HRP抗体结合，即不能把PAP复合物连接在非特异性抗体上。
当然，PAP复合物中也可能存在某些非特异性抗体，假如这部分抗体能够与桥抗体及组织成分结合，但因其不是抗HRP抗体，不能与HRP结合，无酶活性，也不会造成背景染色。
(二)PAP法原理
与酶桥法相似，不同的是酶桥法分四步，而PAP法分三步。PAP法将酶桥法的步骤(3)、步骤(4)合二并为一，用PAP复合物替代，故称PAP法(图4—9)。PAP复合物中的抗HRP抗体和第一抗体必须为同一种属动物的IgG，这样桥抗体才能作为“桥”将PAP复合物连接在第一抗体上，如特异性一抗为鼠来源的，那么PAP复合物必须用鼠的。
(三)染色步骤
(1)4um石蜡切片58℃烤片4h，切片常规脱蜡至水。
(2)蛋白酶消化或AR(组织抗原的暴露或抗原的修复，此步视情况而定)
(3)0．3％H20c处理切片20min(室温)，PBS洗3min×2次。
(4)3％正常动物血清处理切片30min(室温)，吸去多余血清，不洗。
(5)适当稀释的特异性一抗孵育(4℃过夜或37℃60min)，PBS洗3min×3次。
(6)滴加桥抗体(二抗)，37℃孵育40min，PBS洗3min×3次。
(7)适当稀释的PAP复合物(要求与特异性一抗同一种属)37℃孵育40min。
(8)PBS洗3min×3次。
(9)0．04％DAB-0．03％H202显色8，-12min。
(10)水洗、复染、脱水、树胶封片，结果观察。
