此法是直接法的重要改进，先用特异性(对细胞或组织内抗原)抗体(或称第一抗体)与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体(也称第二抗体)与结合在抗原上的抗体(是第二抗体的抗原)结合，形成抗原—抗体—荧光抗体的复合物。由于结合在抗原—抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。

 

    如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3—5分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术，原理见图。

 

 

    间接法操作流程如下。

 

    [标本] 肾穿刺标本冰冻切片，厚5um。

 

    [试剂]

    ①第一抗体：羊抗人IgG抗血清(1：40)、羊抗人IgA抗血清(1：30)、羊抗人IgM抗血清(1：30)。

    ②兔抗羊IgG-FITC(1：30)。

    ③0．01mol／L(pH7．4)PBS。

    ④缓冲甘油(配法同直接法)。

 

    [染色步骤]

    ①肾穿刺标本冰冻切片室温下丙酮固定10rain，PBS洗3X3min。

    ②置切片于温盒内，分别滴加羊抗人IgG、羊抗人IgA及羊抗人IgM等抗血清，37℃，1h。

    ③以PBS洗切片3X5min。

    ④滴加兔抗羊IgG-FITC，37℃，30min。

    ⑤以PBS洗切片3X5min。

    ⑥缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察结果              

    [结果]  肾小球特异生荧光染色呈翠绿色。