免疫荧光组织化学染色方法--补体法
(一)直接检查组织内免疫复合物方法
用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原—抗体复合物上的补体反应，而形成抗原—抗体—补体复合物—抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等，原理见图。
(二)间接检查组织内抗原方法
常将新鲜补体与第一抗体混合后，同时加在抗原标本切片上，经37~C孵育后，如发生抗原—抗体反应，补体就结合在此复合物上，再用抗补体免疫球蛋白的荧光标记抗体与结合的补体反应，形成抗原—抗体—补体—荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一
抗体的检查。
[材料和试剂]
①免疫血清60~C灭活20rain，用Kolmers盐水作倍比稀释成1：2、1：4、1：8…。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价如为1；32，则免疫血清应用1：8稀释。
②补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水即在pH7．4的0，lmol／L PBS中含有0．01％MgS04。
③抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1；4、补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1；4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。
[方法步骤]
①涂片或冰冻切片固定和PBS洗1次，3min，吹风至组织表面无水分。
②吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液(此时免疫血清及补体又都各稀释一倍)滴于切片上，37~C作用30min，置于保持一定温度的染色盒内。
③用缓冲盐水洗2次，搅拌或振动，每次5min，吸干标本周围液体
④滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，37℃，30min，水洗同③。
⑤蒸馏水洗lmin，缓冲甘油封固。
[对照染色] 按间接方法对照进行。
①抗原对照：阳性对照应为“+++”阳性。
②抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清，结果应为阴性。
③灭活补体对照：将补体经56~C处理30min后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等混合后，进行补体法染色，结果阴性。
本法所用荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克次体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质更为理想。
