(一)直接法
(1)石蜡切片脱蜡至水，冰冻切片或细胞涂片经丙酮固定10min，PBS洗3min×2次。
(2)滴加0．3％Hz02甲醇液，室温处理20min，PBS洗3min× 3次(抑制内源性过氧化物酶活性)。
(3)0。l％胰蛋白酶37~C消化20min或AR(只限于石蜡片)，PBS洗3min×3次。
(4)滴加1：(5～20)正常羊血清或牛血清20min(室温或37℃)，吸去多余血清，不洗。
(5)适当稀释的酶标记特异性抗体(一抗)孵育60min 37℃，PBS洗3min×3次。
(6)0．04％DAB+0．03％Hz02显色8—12rain，最好在光镜下控制。
(?)充分水洗，苏木精复染，盐酸乙醇分化15～30s。
(8)常规树胶封片，结果观察。
(二)间接法
(1)～(3)同直接法。
(4)第二抗体的正常动物血清1：20，室温20min(阻断非特异性结合位点)，倾去多余血清，不洗。
(5)适当稀释的特异性抗体(一抗)湿盒37℃中孵育60min，或室温孵育4h，或4℃孵育过夜，PBS洗3min×3次。
(6)酶标记抗体(二抗)37℃孵育40min，PBS洗3rain×3次
(7)DAB／Hz02显色8～12rain，镜下控制。
(8)以下同直接法。
(三)三步酶标间接法
三步酶标间接法是在酶标间接法的基础上再加一步酶标记三抗，信号进一步放大，使敏感性进一步增加。第三步酶标记三抗必须是抗第二步酶标记二抗，例如第三步酶标记二抗是兔抗鼠，第三步酶标记三抗应该是羊抗兔酶标抗体。另外，第二步和第三步酶标抗体所用的酶必须是同一种酶。
(四)酶标记抗原法
该方法仅用一种特异性抗体，抗体必须过量。其原理是抗体中二个抗原结合位点(二价)分别与组织细胞内的抗原和酶标记抗原结合，原理见图4—6。该法的最大的优点是对抗体的特异性和纯度要求不高，可以非常稳定地进行IHC的双重标记，标记二种抗原。
