SPA可为多种示踪物(如荧光素、酶、胶体金、铁蛋白)所标记，应用较广泛的为酶标记SPA和金标记SPA技术。标记SPA常用的酶为HRP，可应用于间接法染色，SPA在PAP法中可代替桥抗体。
1．SPA—HRP在间接法中的应用
由于SPA能结合IgG的Fc段，因此就成为天然的抗IgG，酶标记的SPA可代替酶标记的IgG抗血清，从而测定和定位组织内的IgG或免疫复合物，SPA—HRP的染色步骤如下。
(1)石蜡切片常规脱蜡至水。
(2)3％H202处理15min，以抑制内源性过氧化物酶
(3)TBS洗3X3min。
(4)加第一抗体，孵育30～60min，或4~C过夜。
(5)TBS洗3X 3min。
(6)加适当的稀释的SPA—HRP(1：100～1：400)，孵育30—60min。
(7)TBS洗3X3min。
(8)DAB显色5—10min。
(9)复染、脱水、封片。
2．SPA在PAP法中的应用
SPA除与标记物结合后用于代替第二抗体外，其本身可作为桥抗体用于PAP染色。与标记SPA相似，SPA可与多种动物的第一抗体反应外，还可与多种PAP复合物反应，而不像PAP法需要与第一抗体相同的动物制备的各种PAP复合物。由于SPA与Fc段和Fab段结合为亲和化学反应，不是抗原—抗体的免疫反应，因而反应极为迅速，能大大减少实验时间。此法的敏感性不如PAP法，但背景染色要低于PAP法，而且较为方便。染色步骤如下。 (1)4gm石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3rain。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)。
(3)PBS洗3X3min。
(4)3％过氧化氢(Hz02)孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(5)PBS洗3X3min。
(6)20％蛋清[用0．01mol／L(pH7．3)PBS配制]孵育20min。
(7)PBS洗3X3min。
(8)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗，只需吸去多余血清。
(9)滴加适当稀释的第一抗体，37~C温育60min，或4~C过夜。
(10)PBS洗3X 3rain。
(11)加SPA(1ug／mi)，37~C温育30rain。
(12)PBS洗3X3rain。
(13)PAP复合物(兔或鼠)37~C温育30min。
(14)PBS洗3X3rain。
(15)0．04％DAB(含0．03％Hz02)显色5～10min
