TNF对小鼠L929细胞株的细胞毒作用，如同时加用转录抑制剂放线菌素D，可提高靶细胞对TNF的敏感性10～100倍。利用染料结晶紫(或噻唑蓝，MTr；萘酚蓝黑，NBB)可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，通过测定其OD值来反映细胞存活状态，从而反映TNF的生物学活性。
1．材料 ①L929细胞株；②TNF标准品及待测样品；③0．25％结晶紫(溶于20％甲醇)；④放线菌素D，储存液浓度为100lxg／mL；⑤柠檬酸钠缓冲液：0．9％柠檬酸钠，0．02mol／LHCl，47．5％乙醇。
2．实验方法
(1)结晶紫染色法
1)取对数生长期的L929细胞，以0．01％胰蛋白酶消化用培养液调整细胞浓度至2×105／mL。
2)取96孔培养板，每孔加入100uL细胞悬液，置37℃，5％C02温箱孵育24h。
3)倍比稀释待测样品及TNF标准品(100U／mL～0．1U／mL)，吸去细胞培养上清，每孔分别加入100／tL稀释样品或标准品，各设双复孔，阴性对照孔加培养液，并设空白对照组。同时向各孔加入10／uL放线菌素D(0．5—1ug／mL)，37℃下培养12—14h。
4)离心弃上清，并用PBS洗细胞一次。
5)每孔加入0．25％结晶紫100／uL，室温下染色10min。
6)离心弃上清，用PBS洗一次。
7)室温下晾干，每孔加入100uL柠檬酸钠缓冲液，充分混匀后，于570nm或630nm波长下测OD值。
(2)MrlT比色法：步骤1)～3)同上。
4)直接于每孔加入10uL0．5％MTT，37℃下孵育1h。
5)离心弃上清，每孔加入异戊醇／HCl(0．04mol／L HCl溶于异戊醇中)100uL混匀，测定630nm—570nm波长OD值。
(3)NBB染色法：步骤1)—4)同上。
5)每孔加入100p．LNBB(0．05％NBB，9％醋酸，0．1mol／L醋酸钠)染色30min。
6)弃去染料，用滤纸吸干。
7)每孔加入甲醛固定液(10％甲醛，9％醋酸，0．1mol／L醋酸钠)固定细胞15rain。
8)流水冲洗后，用滤纸吸干。
9)每孔加150uL 50mmol／LNaOH，混匀后，在上述波长下测OD值。
3．结果分析 在正态概率纸上作图，以细胞死亡百分率为纵座标，以TNF标准品浓度为横座标绘制标准曲线，根据导致50％细胞死亡的样品对应的稀释度，计算TNF的活性单位。
4．注意事项
(1)L929细胞不宜生长过密，只要孔内长成单细胞层即可使用
(2)L929细胞随着传代或受其他因素的影响，对放线菌素D的敏感性会有差异，故最好先作预试来确定其使用浓度。
(3)MTr染色，其着色深浅不但与活细胞的多少有关，而且也与细胞的激活有关，因MTr被活细胞摄取后，在线粒体脱氢酶的作用下，还原成深蓝色的物质。如细胞被某种因素激活后，其代谢加强，线粒体脱氢酶活性亦增强，着色也加深。故用MTI染色时，必须考虑待检样品中是否含有能激活靶细胞的因素，否则会干扰结果的判断。
