膜肿瘤坏死因子(TNF) 生物学活性检测
多聚甲醛固定后的效应细胞或直接用效应细胞的胞膜(其膜表面有跨膜型TNF-a)，按一定比例加入靶细胞，如L929，以观察跨膜型TNF-a对靶细胞的细胞毒活性。
1．材料 ①L929细胞株；②1％多聚甲醛溶于RPMI-1640培养液中；③PBS，pH7．2；④0．5％MFIT。
2．多聚甲醛固定法
(1)以105／孔效应细胞置96孔培养板培养，可加用刺激物，如LPS(100ns／mL)刺激一定时间后，弃上清。
(2)PBS洗一次后，用1％多聚甲醛RPMI—1640室温下固定15—20min，用PBS洗数次以去除多余甲醛。
(3)按效／靶细胞为10：1的比例加入靶细胞104／孔，分别设仅有靶细胞的对照组及仅有效应细胞的对照组，终末体积100uL，37C，培养48h。
(4)加入10uLMTF／孔，孵育4ho
(5)再加入100gL0．IMmol／LHCl／10％SDS，37℃过夜。
(6)于波长570nm或630nm下测OD值。
(1)单核细胞置于平皿经刺激或不刺激培养后，用RPMI-1640洗三次。
(2)在平皿中加入0．5mL RPMI-1640，用橡皮刷将单核细胞刮下，悬浮于PBS(含lmmol／LEDTA及lmmol／LPMSF)中。
(3)破膜 将单核细胞放人“液氮细胞裂解器”，20min，350psi。
(4)2 500r／min离心10min，取上清。
(5)将上清置于43％蔗糖(溶于A溶液：10rmnol／L HEPES pH7．33mmol／LMgCl2)，200 000Xg离心45rain，在蔗糖界面收集细胞膜。100mmol／L KCI
(6)用溶液A将细胞膜洗一次，175 000Xg离心60min，以去除残留的蔗糖。
(7)将膜悬浮于RPMI-1640中，蛋白浓度为2—5mg／mL，—70~C冻存。用于生物活性检测的浓度为10ug／孔，其余步骤同上。
