放射受体测定法测定转化生长因子TGFβ
1．培养上清中TGF-β的激活 测定前必须使无血清培养上清中TGF-β激活。激活有热激活和酸激活两种方法，热激活法是通过将标本加热至80℃5min而激活。酸激活法的步骤如下：
①在200uL无血清培养上清中加6mol／LHCl 1．5ul，使pH≤3．0，22℃孵育30rain；
②用30ul中缓冲液中和，调至pH7．0～7．4。若pH值不在此范围，可加少量1：10稀释的6mol／LHCl或中和缓冲液调整(中和缓冲液为6mol／LNaOH和1mol／LHEPES等量混合而成)；
③用于胸腺细胞增殖法测定前，标本用RPMI-1640稀释4倍。
2．在24孔培养板中加A549
细胞1．7X105／孔，在完全DMEM培养液中培养18～24h，以形成A549细胞单层，用结合缓冲液(含0．1％BSA的磷酸盐缓冲液)洗涤1次。
3．在培养板的前四排中，用结合缓冲液对重组或纯化TGF-p进行系列稀释，浓度范围为1—1 000pmol／L，每孔200gL，用于绘制TGF-p的标准曲线；后两排中，加系列稀释的酸激活待测上清，200uL/孔。
4．将培养板置于22℃振荡2h，用冷结合缓冲液洗3次，每孔加200／uL 50pmol／L125I-TGF-β，22℃孵育2h。
5．同上洗2次后，加600~L解离缓冲液，22℃作用20min，使细胞解离。解离缓冲液的配方为：20mmol／LHEPES、2％TritonX-100和10％甘油。
6．从每孔取500uL，用r计数仪测定放射活性。
7．通过测定外标记TGF-
β过量时(10nmol／L)的细胞放射活性，估计非特异性结合，以重组TGF-
β的稀释度对放射活性绘制标准曲线。根据cpm值从标准曲线上读取样本中的TGF-
β含量。
