γ-干扰素IFN-γ的测定
1．上述测定IFN-e效价的方法也适用于IFN-7抗病毒活性的测定，但需用IFN-γ标准品作对照，同时检品常按1：2比例稀释。
2．MHC—Ⅱ类抗原诱导法IFN-7是诱导MHC-I类和Ⅱ类抗原表达的主要细胞因子之一，用抗MHC-Ⅱ类抗原的McAb可定量测定IFN-γ活性。
(1)用完全培养液配制IFN-γ标准品2．0mL，浓度为1 200U／mL(对人和鼠IFN-γ分别
为40和120ng／mL)，再按1：3系列稀释5个稀释度(取前液0．6mL，加完全培养液1．2mL)，
培养液种类根据所用细胞决定。
(2)待测样本准备4个稀释度，原浓度和按1：10稀释3个浓度。
(3)用培养液将指示细胞(Colo-205或WEHI-3细胞)配成8×105／mL。
(4)加2．0mL完全培养液，1．0mL指示细胞悬液和1．0mLIFN-7标准品或标本于12孔培养板，设空白对照，常规培养48h。
(5)用橡皮玻棒轻擦每一培养孔，使细胞与孔底分离，用吸管吹吸3次使成单细胞悬液，将细胞转入12X75mm塑料试管，以后步骤无需无菌操作。
(6)1 000r／min4~t2离心10min，去上清，用3mL洗液重悬细胞，同上离心，去上清。
(7)用含1％正常鼠血清的洗液250tzL重悬细胞，4℃孵育30min。
(8)每孔加1001TL生物素化抗MHC—Ⅱ抗原的McAb 5ug／mL，4℃孵育60min。
(9)用4℃ PBS洗细胞3次，然后用4℃预冷的PBS 250uL悬浮细胞。
(10)用4℃ PBS将链霉亲合素-F1TC稀释5倍，每孔加100uL，4℃孵育30min。
(11)同上洗2次，用500uL4℃PBS悬浮细胞。
(12)用流式细胞仪测
细胞荧光，减去背景荧光(即只用链酶亲合素-FITC处理的未刺激细胞的自发荧光)，以确定特异性荧光强度。
(13)以荧光强度对IFN-γ标准品浓度作图绘制标准曲线，从标准曲线上读取待测样品的IFN-γ浓度。
3．双抗体夹心、ELISA法 在获得抗IFN-~McAb和多克隆抗血清时，可用此法测IFN-γ量。
[附]：VSV培养液的制备及稀释度估算。
1．接种Vero细胞于150cm2培养瓶，用完全DMEM液培养。
2．待细胞形成单层后，倾去上清，每瓶感染2．5X105个蚀斑形成单位(PFU)的VSV(于3mL培养液中)，37C 5％C02条件下温育45rain，使病毒吸附于细胞。
3．每瓶补充培养液12mL，同上培养24h，当CPE>5％时，收集细胞，500r／min离心10min，去细胞碎片。
4．在冰浴中将各瓶病毒上清混合，分装成每支0．5mL或lmL，—70℃保存(—20℃时病毒易失活)。
5．用蚀斑测定法测定病毒贮存液的PFU／mL，估算用于IFN活性测定时的病毒稀释度。例如，测得VSV贮存液的活性为1×10
9PFU／mL，MOl为(multiplicityofinfection，即病毒感染细胞比)为0．1，即每10个细胞感染1个病毒，L929细胞的浓度为2×10
5／孔，每孔加入的VSV稀释液为100uL，则稀释倍数应为1：5 000。
