放射受体测定法测定干细胞因子
本法可用于检测低水平的人或鼠SCF。根据非标记SCF与已知量的125I-SCF竞争性地与OCIMl细胞膜上的SCF受体结合的原理，通过与标准品对照，可测知标本中SCF含量。OCIMl是人红白血病细胞系，可表达高水平SCF受体(140 000个/细胞)。
(一)OCIMl细胞膜的制备
1．将OCIM，细胞培养于IMDM—10液中(悬浮生长)收获细胞，用无Ca2+、Mg2+的PBS洗涤离心后，用20mL含葡萄糖和丙酮酸钠的PBS重悬细胞。
2．将细胞悬液置于预冷的45mL
细胞破碎泵，5001b／in2加压15min以达到平衡，减压以破碎细胞。
3．镜下检查细胞破碎情况，以破碎率达90％为理想。若细胞破碎率小于80％，则需重新破碎。
4．用80mL蔗糖缓冲液重悬细胞碎片，转入2支40mL离心管，4 350Xg离心10rain。
5．取上清装入另两支洁净离心管，同上离心进一步清除细胞碎片。
6．转上清至另两支离心管，31 000Xg离心30nfin。
7。小心除去上清，将沉淀溶于80mL蔗糖缓冲液，分装于4支离心管中。
(二)胞膜片段的纯化
1．用20mL注射器18号针头小心插入标本底部，小心注入36％的冰冷蔗糖缓冲液抬起标本，直至距试管口5mm。
2．小心将试管放入离心机(注意勿破坏界面)，140 000Xg离心15rain。
3。仔细取出试管，收集处于界面上的膜片段，加冰冷蔗糖缓冲液至80mL。
4．将上述液体分装于两支离心管中，31 000Xg离心30min。
5．去除上清，合并两管沉淀物，并将其溶于4mL冰冷TE缓冲液中，用吸管吸吹使之充分混匀，分装于冻存管5012L／管，—70~C贮存，保存期不超过1年。
(三)膜最佳稀释度的确定
1．在1．5mL离心管中，用测定缓冲液(含0．25％BSA的50mmol／LTris-HCl，pH7．5)对膜制剂进行倍比系列稀释。
2．对每一稀释度，设置下列试验管，且各设3管：①非特异性结合管(NSB)：为含700ngrSCF的150／uL冷测定缓冲液；②最大结合管(BO)：为150~L冷测定缓冲液；③总计数管(TC)：为200ral冷测定缓冲液。
3．用测定缓冲液将IzSI_SCF稀释成1 000cpm／／2L。上述每管各加50ral，摇匀。
4．加各稀释度的膜制剂50uL于各NSB和BO管中，摇匀，置2—8℃孵育18～24h。
5．每管加400t~L冷测定缓冲液，42100Xg离心8min。
6．除TC管外，吸出各管上清，用丁射线计数仪测定每一标本(沉淀)的放射活性lmin。
7．计算每个膜稀释度特异性结合的百分率：
特异性结合百分率(％)=(BO—NSB)／TC
以产生20％(18％～22％)特异性结合的膜稀释度为最佳稀释度，进行下述竞争性试验。
(四)样本SCF含量的测定
1．用测定缓冲液将人或动物rSCF标准品稀释成200ng／mL，再在1．5mL离心管中作系列倍比稀释至终浓度为0．1ng／mL，每管150uL。
2．同上对待测样本进行系列稀释。
3．同上述(三)(2)设置对照，因只有一个膜稀释度，故只需3管。
4．每管加125I-SCF液50uL(浓度同上)。
5．每管加50／uL已稀释的最佳浓度膜制剂(TC对照管除外)混匀，4~C孵育18—24h。
6．同上述(三)(5)～(7)步骤对各管进行操作。
7．绘制标准曲线，根据cpm值从标准曲线上查知待测标本的SCF水平。
