IL-6的生物学检测法
1．IL-6依赖细胞增殖反应测定法 常用的IL-6依赖细胞株有T1])I、B9、MH60·BSF2、7TDl、KD823，其中以MH60·BSF2细胞使用最多。
(1)取对数生长期的MH60·BSF2细胞，用Hanks液洗2次，重悬于培养液中30min。
(2)将待测样本和标准品IL-6倍比稀释，分别加入96孔板孔中，每孔加入100gL。
(3)将悬浮细胞离心弃上清，配成2X105／mL细胞，加入1001~L于各孔中。
(4)37~C 5％C02温箱中培养48h后，加MTr，继续培养4ho
(5)离心弃上清，加酸化异丙醇溶解甲脂，测OD值，计算IL-6活性单位。
2．SAC协同刺激B细胞分化反应测定法
(1)分离小鼠脾B淋巴细胞，详见IL-4测定。
(2)SAC协同刺激B细胞分化反应：①将不同稀释度的待测样品加入96孔板，100uL／孔，再加入B淋巴细胞悬液(4×106／mL)50／~lJ孔；②加入金黄色葡萄球菌Cowan-I株(SAC)悬液50rtL／孔，终浓度为0．02％。在37％，5％c02温箱中孵育4～5d，取出培养板离心后收集细胞上清。
(3)ELISA测上清IgC含量：步骤同常规ELISA法。IL-6活性以ELISA法测定的OD值表示，亦可用IgG浓度(ng/ml)表示。
(4)注意事项：①由于SAC来源、批次不同，测定IL-6前应做SAC刺激B淋巴细胞增殖反应曲线，选择最适SAC浓度；②亦有实验室将SAC和B淋巴
细胞反应2d后，洗出SAC，加入IL-6待测样品继续培养5d，然后测细胞上清中IgG含量。
3．CESS细胞分化反应测定法 CESS细胞在IL-6作用下分化成免疫球蛋白分泌细胞，通过采用SPA溶血空斑法测定CESS细胞分化成Ig分泌细胞的数量，即可间接测定IL-6含量。
(1)SPA-SRBC的交联：取1份生理盐水稀释的SPA(0．5mS／mL)，10份氯化铬溶液(2．5×104moL／L)及1份压积的SRBC(先用生理盐水洗3次)，迅速混匀，30％温育1h，并不时摇动。先用生理盐水洗1次，再用Hanks液洗2次。交联的SPA-SRBC置4cC可保存3d。
(2)将不同稀释度的待测上清加入96孔板， 100~tL／孔。加入CESS细胞1 ×104／(100uL/孔)，培养3d后，收集细胞洗3次用于测定。
(3)SPA-SRBC用HBSS洗1次，稀释成30％的SPA-SRBC，取200L并加入CESS细胞悬液100bLL，加稀释成最适浓度的抗人IgC抗体20ul和1：4稀释的豚鼠血清20／uL，混匀。
(4)混匀后的反应物迅速加入在45~C保温的0．5％琼脂(内含DEAE-葡聚糖0．75mg／mL)300／~L中，摇匀后快速倒于培养皿或玻片上，凝固后置湿盒，37~C温育4-6h，直接在低倍镜下计数空斑。结果以PFC数八04细胞±SD表示。
(5)注意事项：①兔抗人IzC优于羊抗人IgC，因前者与SPA结合更有效；②豚鼠血清应用羊红细胞吸收，否则血清中的某些抗体可造成SRBC裂解。
4．SKW6-CIA细胞分化反应检测法 SKW6-CIA细胞在IL-6作用下可分泌IgM，分泌量与IL-6剂量相关。
(1)将不同稀释度的待测上清加入96孔细胞培养板，100／~L／孔，再加SKW6-CL4细胞每孔4X103／100gL，培养3d收集上清。
