Kbaffan等(1986)首先创立了蓝色荧光素标记和染色技术，可进行双重标记或多重标记。
(1)取7—氨基—4—甲基香豆素(?—amino-4—methyl coumarln，AMC)260~g溶于25／(1二甲基亚砜中。
(2)将上液加入10mllgG—巴比妥缓冲液(0．5mol／L，pH8．5，内含50～100mg lgG)中，室温反应2h，过SephadexG-50柱除去游离荧光素，最大荧光波长430nm。AMC呈黄色结晶固体，最大吸收波长354nm。
荧光素的种类不同，标记方法也有所不同，但所要求的条件和步骤大致相同。影响标记的因素主要有温度、pH及反应液中荧光素和免疫球蛋白二者的比例。温度低，标记时间长；温度高，标记时间短。
在0—4℃时，FITC标记抗体搅拌6～12h；在7—9℃搅拌4h为宜。pH以9．o～9．5最适于免疫球蛋白的标记，一方面异硫氰酸荧光素在弱碱性条件下易于溶解，另一方面，在弱碱性环境下免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于结合。pH偏低，标记慢；pH偏高(大于pHl0)，抗体易变性。
