DNA合成的亚磷酰胺三酯法
亚磷酰胺三酯法合成
DNA片段，已被DNA合成仪广泛使用，使得合成DNA片段成为一件非常简单易行的工作。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端，相邻的核苷酸通过3，一5，磷酸二酯键连接。
合成的第一步是将预先连接在固相载体上其活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5，—羟基的保护基团DMT，获得游离的5，—羟基；
第二步，合成DNA的原料(亚磷酰胺保护核苷酸单体)与活化剂四氮唑混合，得到反应活性很高的核苷亚磷酸活化中间体(它的3’端被活化，5’—羟基仍然被DMT保护)，与溶液中游离的5，—羟基发生缩合反应，这个反应时间很快。
第三步是带帽反应，缩合反应中可能有的极少数5，—羟基没有参加反应(合格的合成试剂缩合效率一定会大于98％，所以未参加反应的少于2％)，合成过程使用乙酸酐和l—甲基咪唑使这些核苷5’—羟基反应形成酰，终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。这步反应同样是快速高效的；
第四步，缩合后在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5’—羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
