碱性磷酸酶为二聚体蛋白，是一种含锌的金属酶，每分子酶至少含2个Zn原子。酶上3类金属结合位点，即所谓的催化(A)、结构(B)和调节(C)位点，两个A位点的结合则只会导致一个亚单位的磷酸化，即负协作亚单位相互作用(negativecooperativesubunitinteraction)，而当加入金属离子(例如Mg2+)结合B和C位点时，上述负协作亚单位相互作用即随之消除，2个亚单位都被磷酸化。每个亚单位Znz+结合于3个不同的组氨酸残基，其中至少1个位于A位点。
碱性磷酸酶用于ELISA必须注意的是含磷酸盐的缓冲液对其酶活性的抑制作用，因为在ELISA中所使用的温育和洗涤缓冲液一般均为磷酸盐缓冲液生理盐水(PBS)，含有相对高浓度的磷离子(15retool／L)，对碱性磷酸酶有很强的抑制作用，尽管最后显色反应的底物在另一种缓冲液中，但前面PBS洗板所残留的PBS，足以抑制约一半的酶活性。因此如试剂盒标记用酶为碱性磷酸酶，则温育和洗涤缓冲液不能使用PBS溶液。
