磷酸二酯法的基本原理是将两个分别在5，或3，端带有适当保护基的脱氧核苷酸连接起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸。所采用的原料是脱氧核苷酸和脱氧单核苷酸，它们都是多功能团的化合物。
因此，为了保证合成反应能够定向地进行，必须将不参加反应的基团用适当的保护基团选择性地保护起来，原则是不论是5’保护基团还是3’保护基团，都要能够用适当的方法消除掉。一端脱保护的二核苷酸分子，又能同另一个带3’保护基团的单核苷酸进行第二次缩合反应，形成一个三核苷酸分子。
这样从缩合反应开始，到保护基团的消除，再进行新一轮缩合反应。如此反复进行多次，直到获得所需长度的寡脱氧核苷酸为止。
