进行中的核转录分析同时分析多种基因的转录活性
如前所述，Northern印迹杂交不能直接反映mRNA转录效率，而需作进行中的核转录分析(nuclearrunOntranscriptionassay)。
mRNA转录在
细胞核内进行，因此首先需分离细胞核，让细胞核内原已开始的mRNA转录在体外合适的反应条件下继续进行，并同时摄取[32p]—UTP，从而将一定时间内体外转录的mRNA标记；然后提取核RNA，与已转移到尼龙膜上的、同待检mRNA互补的cDNA杂交。如某一mRNA转录活性加强，则该RNA标记也增加，特异杂交体亦相应增多，它可直接反映单位时间内特定mRNA的转录量。此法可同时分析多种基因的转录活性。
1．材料
(1)胞膜裂解液：10mmol／LTris／HCl(pⅢ．5)含10mmol NaCl，3retool MgCla，0．4％NP-40(WV)及lmmolDTl7。
(2)反应缓冲液：20mmol／LTris／HCl，pH8．0含5mmol MgCl2，140mmol KCl，1mmol DTF，0．1mmolEDTA及20％甘油。
(3)杂交液：50％甲酰胺，4×SSC，5×Denhardts液，0．1％SDS，18nunol／L磷酸盐缓冲液pH7．0，100,ug／mL变性鲑精DNA。
(4)50×Denhardts液，1％BSA，1％Ficoll，1％聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
2．操作步骤
(1)将细胞用冷PBS洗一次，离心后，将细胞悬浮于胞膜裂解液中，置冰上5min，经过此处理，可将细胞膜裂解，而细胞核则保持完整。
(2)将细胞核用反应缓冲液洗一次，再于300~L反应缓冲液(已加Immol／LATP、CTP、GTP及200t~Ci[32p)—UTP)中，37~C孵育30rain。
(3)加入异硫氰酸胍终止反应，按RNA一步提取法(见第十九章)提取RNA，在乙醇沉淀过程中可将游离[32p]—UTP与掺人到RNA中的[32p]—UTI分离开。
(4)用p-射线计数仪测定各样品放射活性，并将各样品放射活性调整成一致。
(5)将特定eDNA通过Slotblot或Dotblot(详见第十九章)转移到NC膜或尼龙膜上。
(6)将膜放于杂交液中，于45~C预杂交4h。
(7)将标记核RNA于70~C变性5min，加入杂交液中(放射活性至少为107cpm／mL)，45~C杂交48h。
(8)将膜于室温下用2× SSC／0．2％SDS洗3次，每次30min，然后于60~C用0.1×SSC／0．1％SDS洗2次，每次30min。
(9)在膜上压X光片，于—70~C曝光过夜或数天，显影、定影后，观察结果。
(10)放射自显影片也可作密度扫描，对结果进行半定量测定。
3．注意事项 胞膜裂解液中NP-40的浓度应根据所使用的细胞种类不同而异，最好先作预试，使用浓度以刚好破坏细胞膜而不损害核膜为合适。
